无核白葡萄体细胞胚再生体系建立与转基因研究

【摘要】本研究以欧洲葡萄无核白（VitisviniferaL.cv.ThompsonSeedless）以及火焰无核（VitisviniferaL.cv.FlameSeedless）为材料，通过调节胚性愈伤组织诱导时外植体和培养基种类、成胚培养基的类型、胚萌发时蔗糖浓度、胚成苗时所需要BAP的量等参数，建立与完善体细胞胚的再生体系。通过二次体细胞胚再生途径和液体悬浮培养等手段将胚性组织保持、扩繁并对萌发时畸形的葡萄体细胞胚通过胚性愈伤组织再诱导的利用。基于胚性材料，分别从受体类型、筛选浓度、筛选方法、成苗四个方面建立优化葡萄的遗传转化体系。通过获得的遗传转化体系，将本实验室前期获得的中国野生华东葡萄白河-35-1的芪合成酶基因转入欧洲葡萄无核白中，获得转芪合成酶基因的无核白葡萄新种质，研究转芪合成酶基因的功能和转基因植株中的表达产物；为利用转基因技术改良欧洲葡萄品种的抗病性，获得葡萄抗病新种质提供依据。取得的主要结果如下：1.建立了欧洲葡萄无核白和火焰无核的体细胞胚再生体系。以单核期的小花蕾经过二次NaClO消毒后诱导胚性愈伤组织较适宜，诱导效率为0.8%-1.9%。初步确定为含有60g/L的蔗糖的X6培养基为成胚培养基。成熟的体细胞胚萌发时采用不含激素且蔗糖浓度为15g/L的MS培养基，弱光培养为最佳，萌发的胚成苗时则需要在固体MS基础培养基中添加0.2mg/LBAP光下促进成苗。2.建立了葡萄体细胞胚保持与扩繁的循环系统。处于鱼雷期和中子叶期的体细胞胚诱导胚产生二次胚性愈伤组织最多，诱导率为80%左右；诱导培养基为ECRM1（MS+2mg/LBAP+1mg/L2,4-D+60g/LSucrose+3g/LPhytagel）和ECRM3（MS+1.1mg/LBAP+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/LNOA+30g/LSucrose+7g/LAgar），萌发前较成熟的体细胞胚诱导率最低（约40%）。在葡萄体细胞胚保持与扩繁的循环系统中，产生了金黄色的胚性愈伤组织（EC）、原胚团（PEM）和体细胞胚（SE）三种胚性材料，用于以后的遗传转化研究。这种体细胞胚的保持系统已经持续了3年，系统中所产生的PEM用B5+0.6mg/LPIC+30g/Lsucrose进行液体培养基悬浮扩繁。此外，本研究对无核白葡萄萌发过程中出现的畸形体细胞胚进行了诱导再分化成正常的体细胞胚的利用。通过研究萌发时蔗糖的浓度、BAP的激素浓度和基本培养基的类型发现，体细胞胚萌发过程中降低畸形胚产生的培养基为：MS+15g/LSucrose+30g/LAgar。通过对3种畸型的体细胞胚子叶、胚轴、胚根二次胚性愈伤组织的诱导结果表明：融合状子叶的萌发胚将子叶切下，并于ECRM1上培养可诱导出胚性愈伤组织，诱导率为72.2%。3.建立了农杆菌介导的无核白葡萄遗传转化体系。通过对受体类型、抗生素浓度、抗生素筛选方式、成苗方式的研究，获得较好的遗传转化体系为：使用PEM为受体，进行农杆菌侵染，筛选时采用75mg/L卡那霉素（Kan），延迟3-4周进行筛选，抗性胚出现较多，抗性体细胞胚萌发时将抗性胚于含有25mg/Lkan培养基上进一步筛选培养15天，转基因胚变绿萌发。成苗时将萌发的抗性苗分别在两种成苗培养基(MS+0.2mg/LBAP+30g/LSucrose+7g/LAgar和MS+0.25mg/LKT+30g/LSucrose+7g/LAgar)上交替培养可以促进抗性苗的健壮生长。4.分别获得了转泛素连接酶基因和芪合成酶基因植株171株和81株。通过PCR、Southernblot、RT-PCR等分子手段对抗性苗验证表明次抗性株系中均为转基因葡萄株系。其中含VpPUB23载体的转基因无核白葡萄70株（PCR以及RT-PCR阳性），选取6个株系进行Southernblot检测为阳性；转VpUU2基因无核白葡萄25株，转VpUR9基因的转基因无核白葡萄76株，初步的PCR检测为阳性株系。共获得转芪合成酶基因（pC-35S-VpSTScDNA-2-GFP载体）的无核白葡萄81株系，初步的PCR与RT-PCR为阳性。而全面的Southernblotting、Northernblotting和Westernblotting检测所有转基因植株，确定其真伪转基因植株是本研究的基本要求，检测工作正在进行中。5.利用RT-PCR和高效液相色谱（HPLC）技术对转芪合成酶基因（STS）无核白植株进行分析检测，转芪合成酶基因植株通过HPLC对芪合成酶基因表达产物测定表明，转芪合成酶基因无核白葡萄叶片中可以检测到两种芪类化合物，分别为顺式云杉新苷和反式云杉新苷；其中，转基因无核白葡萄叶片中芪类物质顺式云杉新苷（cis-piceid）含量在22.9-50.4μg/gFW之间，比野生型提高了9.2-21倍；反式云杉新苷(trans-piceid)的含量在12.1-36.3μg/gFW之间，比野生型提高了2.4-7.4倍。通过21个中国野生葡萄品系果皮、果肉、种子和叶片中的芪类物质的含量对比发现，转基因无核白葡萄幼叶中云杉新苷的含量要高于所有野生种叶片的含量，且高于多数野生种葡萄果皮中云杉新苷的含量。通过RT-PCR对转基因无核白葡萄芪合成酶家族基因的表达分析表明，转基因无核白葡萄中部分STS基因上调，但查尔酮合成酶基因（CHS）表达水平与野生型无显著差异。进一步，对转芪合成酶基因无核白葡萄植株，用白粉病菌人工接种鉴定，初步的接种鉴定结果表现为，转基因株系对白粉病菌的抗性高于野生型植株。全面系统的进行白粉病菌人工接种鉴定转基因植株是转基因研究的基础环节和必然要求，鉴定工作正在进行中。
【作者】周起；
【导师】王跃进；张剑侠；张朝红；徐炎；
【作者基本信息】西北农林科技大学，果树学，2014，博士
【关键词】葡萄；体细胞胚；再生体系；转基因；抗病育种；

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